La fenotipizzazione automatizzata ad alto rendimento come scorciatoia per biostimolanti più efficaci: Dai semi alle colture

A cura di: Mirella Sorrentino1^,4, Nuria de ^Diego2, Giuseppe ^Colla3, Lukáš ^Spíchal2, Youssef ^Rouphael4 e Klára Panzarová1^,*^*email: panzarova@psi.cz

^1PSI(Photon Systems Instruments), spol. s r.o., Drasov, Repubblica Ceca

^{2Dipartimento}di Biologia Chimica e Genetica, Centro della Regione Haná per la Ricerca Biotecnologica e Agricola, Facoltà di Scienze, Università Palacký, Olomouc, Cechia

³Dipartimento di Scienze Agrarie e Forestali, Università della Tuscia, via San Camillo De Lellis snc, 01100 Viterbo, Italia

^{4Dipartimento}di Agraria, Università di Napoli Federico II, via Università 100, 80055 Portici (NA), Italia

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Lo sviluppo di biostimolanti altamente efficaci richiede un'accurata valutazione degli effetti dei prodotti candidati sui tratti morfo-fisiologici di colture selezionate durante le diverse fasi di sviluppo e condizioni ambientali. Poiché i metodi di screening convenzionali richiedono molto tempo, sono distruttivi e richiedono molta manodopera, di recente sono state proposte procedure di fenotipizzazione vegetale ad alto rendimento come strumenti efficaci e di alta precisione per lo screening di nuovi prodotti. I sistemi di fenotipizzazione vegetale sono sistemi robotici completamente automatizzati, solitamente installati in un ambiente controllato o in condizioni di serra semicontrollata. Le piattaforme di fenotipizzazione sono progettate per garantire non solo un monitoraggio non invasivo delle piante basato su immagini, con un volume di produzione che va da poche a diverse centinaia di piante, ma anche per fornire mezzi per la coltivazione e la manipolazione automatizzata delle piante, come l'irrigazione/pesatura automatica, la somministrazione di sostanze nutritive o le unità di spruzzatura (1, 2). Le piante possono essere valutate dinamicamente per molti tratti morfo-fisiologici e biochimici legati alla crescita, alla resa e alle prestazioni durante il loro sviluppo o all'inizio, alla progressione e al recupero da uno stress abiotico. Questo approccio consente quindi la caratterizzazione funzionale dei biostimolanti in pianta ad alta precisione e ad alta risoluzione in una determinata fase dello sviluppo della pianta e/o della risposta della pianta alle condizioni ambientali.

Il cosiddetto approccio di fenotipizzazione integrativa in piattaforme di fenotipizzazione multisensoriale è stato recentemente utilizzato per indagare con successo la modalità d'azione dei biostimolanti e individuare i tratti morfo-fisiologici correlati allo stress e alle applicazioni dei biostimolanti (2,3,4). L'ampio spettro di caratteristiche può essere descritto quantitativamente e differenziato qualitativamente includendo sensori di imaging non solo per l'imaging visibile (imaging RGB) e/o l'imaging 3D, ma anche per la spettroscopia di imaging (imaging iperspettrale), l'imaging a infrarossi termici e l'imaging della fluorescenza clorofilliana. L'imaging RGB viene utilizzato per stimare il vero colore di ciascun pixel e, utilizzando algoritmi di elaborazione delle immagini, per identificare i pixel di origine vegetale. Per gli oggetti vegetali identificati, vengono quantificate le caratteristiche morfologiche e geometriche, comprese le proprietà del colore. La valutazione del volume della pianta o dell'area fogliare totale, basata sul numero di pixel, è correlata al peso fresco e secco della biomassa vegetale fuori terra. La crescita delle piante può essere catturata in misurazioni di serie temporali, necessarie per seguire la progressione delle dinamiche di crescita delle singole piante in una determinata fase di sviluppo e/o di risposta agli stress. L'architettura e la forma precise delle piante, come l'altezza, le dimensioni delle singole foglie o la biomassa, possono essere quantificate utilizzando la tecnologia di imaging 3D. Oltre alla caratterizzazione strutturale e morfologica, la caratteristica principale delle piattaforme di fenotipizzazione automatizzate sono i sensori progettati per la cosiddetta fenotipizzazione fisiologica. L'imaging cinetico della fluorescenza della clorofilla (ChlF) è utilizzato per quantificare la capacità fotosintetica delle piante e la loro capacità di raccogliere energia luminosa. La ChlF è una tecnica popolare in fisiologia vegetale utilizzata per la misurazione rapida e non invasiva dell'attività del fotosistema II (PSII). L'attività del PSII è molto sensibile a una serie di fattori biotici e abiotici e pertanto la tecnica della fluorescenza della clorofilla viene utilizzata come indicatore rapido delle prestazioni fotosintetiche delle piante in diversi stadi di sviluppo e/o in risposta ai cambiamenti ambientali. Il vantaggio delle misurazioni della fluorescenza clorofilliana rispetto ad altri metodi di monitoraggio degli stress è che i cambiamenti nei parametri cinetici della fluorescenza clorofilliana spesso si verificano prima che altri effetti dello stress siano evidenti. Inoltre, la termografia è una tecnica molto sensibile utilizzata per misurare la conduttanza stomatica e i tassi di traspirazione idrica delle piante attraverso la quantificazione della temperatura delle foglie e della chioma. La termografia delle foglie è importante per valutare le risposte delle piante al carico termico e alla deprivazione idrica. Infine, la tecnologia di imaging iperspettrale può essere utilizzata per la quantificazione dei profili di riflettanza spettrale delle piante e la caratterizzazione delle proprietà biochimiche delle piante mediante una tecnologia non distruttiva basata sulle immagini. Le immagini iperspettrali possono essere utilizzate per calcolare una serie di indici di riflettanza sull'intera superficie della pianta che si riferiscono alla composizione dei pigmenti della pianta, allo stato dell'azoto o al contenuto idrico delle piante.

Qui presentiamo un esempio di come l'approccio di fenotipizzazione integrativa possa essere applicato per lo screening di idrolizzati proteici (PH) di nuova formulazione e di origine commerciale. L'insieme dei PH è stato sottoposto a screening per la loro funzione putativa di promozione della crescita e/o di alleviamento dello stress su piante sottoposte a uno stress abiotico (salinità) in diversi stadi fenologici. Utilizzando due piattaforme automatizzate di fenotipizzazione ^{PlantScreenTM} sviluppate da PSI (Photon Systems Instruments, Czechia), siamo stati in grado di monitorare la modalità d'azione dei PHs selezionati utilizzando diverse modalità di applicazione in diverse specie di piante e studiate in diversi stadi fenologici. I PH sono stati applicati 1) per rivestimento dei semi, 2) nei substrati di coltivazione o 3) per irrorazione fogliare. Gli effetti dei PHs sono stati valutati quantificando 1) il tasso di emergenza delle piantine di grano, 2) i tratti legati alla crescita della rosetta in Arabidopsis e 3) una serie di tratti morfo-fisiologici in piante di lattuga e pomodoro (Fig. 1). La modalità d'azione biostimolante di PHs è stata caratterizzata dall'analisi quantitativa delle prestazioni fotosintetiche, delle dinamiche di crescita e dell'analisi del colore.

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Fig.1| Pipeline di screening high-throughput per la caratterizzazione funzionale dei PHs. La modalità d'azione dei biostimolanti viene quantificata in diverse specie vegetali attraverso una serie di stadi di sviluppo e utilizzando diverse modalità di applicazione dei biostimolanti nel sistema modulare PlantScreen™ (PSI Research Center, Drasov, Repubblica Ceca).

Il saggio di emergenza e il saggio in vitro sono stati eseguiti nella piattaforma OloPhen XYZ (Centro della Regione Haná per la ricerca biotecnologica e agricola, Olomouc). I due saggi sono stati utilizzati per lo screening iniziale di un gruppo più ampio di sostanze in un intervallo di concentrazioni di applicazione e in condizioni diverse. Utilizzando i due saggi iniziali abbiamo mirato a selezionare i candidati PH più promettenti e le migliori dosi di applicazione per la seconda fase di caratterizzazione approfondita della modalità d'azione morfo-fisiologica delle sostanze selezionate nelle piante coltivate. In breve, nel saggio di emergenza i semi di grano ricoperti con 6 diversi biostimolanti a concentrazione crescente sono stati seminati in un terreno saturo di acqua di rubinetto o arricchito di sale e il loro tasso di emergenza e la loro crescita sono stati monitorati per 12 giorni utilizzando una telecamera RGB. Per la seconda prova, il test in vitro, le piantine di Arabidopsis thaliana di 4 giorni sono state coltivate per 8 giorni in piastre a 48 pozzetti contenenti un terreno arricchito con 13 diversi biostimolanti a concentrazioni crescenti, in condizioni di controllo o di stress salino. Un'immagine RGB di ciascuna piastra è stata scattata due volte al giorno per l'intera durata dell'esperimento. L'aumento dell'area verde, il tasso di crescita relativa e il tasso di sopravvivenza in condizioni di sale sono stati utilizzati per calcolare il Plant Biostimulant Characterization Index (PBC) (3), al fine di identificare le sostanze che si comportano come miglioratori della crescita e/o alleviatori dello stress. Le sostanze con le migliori prestazioni sono state selezionate per la seconda fase di screening nelle colture a foglia eseguite nel Centro di Ricerca PSI. Qui presentiamo i primi risultati di una delle sostanze caratterizzate nel test iniziale come composto che allevia lo stress (Fig. 2). Le piante di lattuga sono state coltivate per 35 giorni in condizioni controllate e sono state annaffiate ogni due giorni con una soluzione nutritiva o con una soluzione di NaCl 80 mM. Il biostimolante è stato applicato due volte alla settimana come spray fogliare. La crescita delle piante è stata quantificata in modo dinamico durante lo sviluppo e l'imposizione del sale (Fig. 2A). La crescita è migliorata nelle piante cresciute sotto sale e irrorate con il biostimolante (Fig. 2B,C), il che si è correlato con il peso fresco delle piante quantificato alla fine della prova (Fig. 2D), confermando infine che la sostanza selezionata agisce come alleviatore dello stress.

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Fig.2| Analisi fenotipica non invasiva basata su immagini di piante di lattuga di controllo e trattate con PH, cresciute in condizioni di controllo o di stress salino, utilizzando il sistema ^{PlantScreenTM} Compact. (A) Immagini RGB (Red Green Blue) segmentate a colori delle piante di lattuga durante il periodo di fenotipizzazione, dal^10° al^31° giorno dopo la stratificazione (DAS). (B) Area proiettata dei germogli di piante di lattuga coltivate in condizioni di controllo o di stress salino e sottoposte a trattamento con biostimolante. I valori sono espressi in ^mm2 e rappresentano la media di dieci repliche biologiche per trattamento ± deviazione standard. (C) Area proiettata dei germogli delle piante di lattuga nell'ultimo giorno di fenotipizzazione. I valori rappresentano la media di dieci repliche biologiche per trattamento. Le barre di errore rappresentano la deviazione standard. (D) Peso fresco dei germogli di lattuga raccolti al termine del periodo di fenotipizzazione (31 DAS). I valori rappresentano la media di dieci repliche biologiche per trattamento. Le barre di errore rappresentano la deviazione standard.

Visti i promettenti risultati ottenuti, studieremo la modalità d'azione di una serie più ampia di biostimolanti selezionati dallo screening iniziale in vitro e ne caratterizzeremo l'attività nelle colture a foglia e a frutto, rispettivamente lattuga e pomodoro.

In sintesi, i dati preliminari qui presentati dimostrano che la fenotipizzazione automatizzata ad alto rendimento si è rivelata uno strumento potente, che ci ha permesso di seguire le prestazioni della pianta per tutta la sua vita, in tutti gli stadi di sviluppo, di individuare i tratti morfo-fisiologici correlati allo stress e alle applicazioni dei biostimolanti e di indagare la modalità d'azione delle sostanze. Una valutazione precisa e accurata delle variabili fenotipiche è fondamentale per caratterizzare e quantificare l'attività biostimolante di vari prodotti selezionati come potenziali miglioratori della crescita e/o alleviatori dello stress. Le tecnologie di fenotipizzazione ad alto rendimento, che stanno lentamente ricevendo un'attenzione crescente ai fini dello screening e dello sviluppo dei prodotti, potrebbero in futuro fornire mezzi molto efficienti in termini di tempo e di costi per lo screening di nuove sostanze, dosi ottimali, tempi di applicazione e modalità d'azione dei composti con attività biostimolanti.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato sostenuto dal programma di ricerca e innovazione Horizon 2020 dell'Unione Europea nell'ambito dell'accordo di sovvenzione Marie 826 Skłodowska-Curie n. 675006, dal progetto PHOBOS Prot. 2017FYBLPP e dalla Rete ceca di fenotipizzazione vegetale (CzPPN).

Riferimenti:

La fenotipizzazione automatizzata ad alto rendimento come scorciatoia per biostimolanti più efficaci: Dai semi alle colture

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