Высокопроизводительное автоматизированное фенотипирование как кратчайший путь к более эффективным биостимуляторам: От семян к культурам

По: Мирелла Соррентино1^,4, Нурия де ^Диего2, Джузеппе ^Колла3, Лукаш ^{Спихал2}, Юссеф ^{Руфаэль4} и Клара Панзарова1^,*^*email: panzarova@psi.cz

^1PSI(Photon Systems Instruments), spol. s r.o., Драшов, Чешская Республика

^{2Департамент}химической биологии и генетики, Центр региона Гана для биотехнологических и сельскохозяйственных исследований, факультет естественных наук, Университет Палацкого, Оломоуц, Чехия

³Факультет сельского хозяйства и лесных наук, Университет Тушии, via San Camillo De Lellis snc, 01100 Витербо, Италия

^{4Департамент}сельского хозяйства, Неаполитанский университет Федерико II, via Università 100, 80055 Portici (NA), Италия

data-src="/wp-content/themes/yootheme/cache/Soy-bean-seed-to-cropped-646d18a6.webp"

.

Разработка высокоэффективных биостимуляторов требует точной оценки влияния продуктов-кандидатов на морфо-физиологические признаки выбранных культур на разных стадиях развития и в различных условиях окружающей среды. Поскольку традиционные методы скрининга отнимают много времени, разрушительны и трудоемки, недавно были предложены высокопроизводительные процедуры фенотипирования растений как эффективные и высокоточные инструменты для скрининга новых продуктов. Системы фенотипирования растений - это полностью автоматизированные роботизированные системы, обычно устанавливаемые в контролируемой среде или в полуконтролируемых тепличных условиях. Платформы фенотипирования предназначены не только для обеспечения неинвазивного мониторинга растений на основе изображений при пропускной способности от нескольких до нескольких сотен растений, но также обеспечивают средства для автоматизированного выращивания и обработки растений, такие как автоматический полив/взвешивание, доставка питательных веществ или опрыскивание (1, 2). Растения можно динамически оценивать по многим морфо-физиологическим и биохимическим признакам, связанным с ростом, урожайностью и производительностью на протяжении всего периода их развития или начала, развития и восстановления после абиотического стресса. Таким образом, этот подход позволяет проводить функциональную характеристику биостимуляторов in planta с высокой точностью и разрешением в определенной фазе развития растений и/или реакции растений на условия окружающей среды.

Так называемый интегративный подход к фенотипированию в мультисенсорных фенотипирующих платформах был недавно использован для успешного изучения способа действия биостимуляторов и выделения морфо-физиологических признаков, связанных со стрессом и применением биостимуляторов (2,3,4). Широкий спектр признаков может быть количественно описан и качественно дифференцирован путем включения датчиков визуализации не только для видимой визуализации (RGB визуализация) и/или 3D визуализации, но и для визуализации спектроскопии (гиперспектральная визуализация), тепловой инфракрасной визуализации и визуализации флуоресценции хлорофилла. RGB-изображение используется для оценки истинного цвета каждого пикселя и с помощью алгоритмов обработки изображений для идентификации растительных пикселей. Для идентифицированных растительных объектов количественно оцениваются морфологические и геометрические характеристики, включая цветовые свойства. Оценка объема растений или общей площади листьев на основе количества пикселей коррелирует со свежим и сухим весом биомассы наземных растений. Рост растений может быть зафиксирован в виде временных рядов измерений, которые необходимы для отслеживания динамики роста отдельных растений в определенной фазе развития и/или реакции на стресс. Точная архитектура и форма растений, такие как высота, размер отдельных листьев или биомасса, могут быть определены с помощью технологии трехмерной визуализации. В дополнение к структурной и морфологической характеристике ключевой особенностью автоматизированных платформ фенотипирования являются датчики, предназначенные для так называемого физиологического фенотипирования. Кинетическая визуализация флуоресценции хлорофилла (ChlF) используется для количественной оценки фотосинтетической способности растений и способности собирать световую энергию. ХЛФ - популярный метод в физиологии растений, используемый для быстрого неинвазивного измерения активности фотосистемы II (PSII). Активность PSII очень чувствительна к ряду биотических и абиотических факторов, поэтому метод флуоресценции хлорофилла используется в качестве быстрого индикатора фотосинтетической производительности растений на различных стадиях развития и/или в ответ на изменение окружающей среды. Преимущество измерений флуоресценции хлорофилла перед другими методами мониторинга стрессов заключается в том, что изменения кинетических параметров флуоресценции хлорофилла часто происходят до того, как становятся очевидными другие эффекты стресса. Кроме того, тепловидение - очень чувствительный метод, используемый для измерения устьичной проводимости и скорости транспирации воды растениями путем количественного определения температуры листьев и полога. Тепловизионное изображение листьев важно для оценки реакции растений на тепловую нагрузку и водное голодание. Наконец, технология гиперспектральной визуализации может быть использована для количественной оценки профилей спектрального отражения растений и характеристики биохимических свойств растений с помощью неразрушающей технологии на основе изображений. Гиперспектральные изображения могут быть использованы для расчета ряда индексов отражения по всей поверхности растения, относящихся к пигментному составу растения, азотному статусу или содержанию воды в растениях.

Здесь мы представляем один из примеров того, как интегративный подход к фенотипированию может быть применен для скрининга недавно созданных и коммерческих гидролизатов белка растительного происхождения (РН). Набор РН был проверен на их предполагаемую функцию стимулирования роста и/или ослабления стресса на растениях, подвергшихся абиотическому стрессу (засоление) на разных фенологических стадиях. Используя две автоматизированные платформы фенотипирования ^{PlantScreenTM}, разработанные компанией PSI (Photon Systems Instruments, Чехия), мы смогли проследить за способом действия отобранных PH, используя различные способы применения на разных видах растений и скрининг на разных фенологических стадиях. РН применялись 1) путем покрытия семян, 2) в среде выращивания или 3) путем внекорневого опрыскивания. Эффект РВ оценивался путем количественного определения 1) скорости появления всходов пшеницы, 2) признаков, связанных с ростом розетки у арабидопсиса и 3) набора морфо-физиологических признаков у растений салата и томата (рис. 1). Способ действия биостимулятора PHs характеризовался количественным анализом фотосинтетических показателей, динамики роста и анализа цвета.

data-src="/wp-content/themes/yootheme/cache/HighThroughput-photo-e1582061945341-d5b9505e.webp"

Рис.1| Высокопроизводительный скрининговый конвейер для функциональной характеристики РН. Способ действия биостимуляторов количественно оценивается у различных видов растений на разных стадиях развития и при использовании различных способов применения биостимуляторов в модульной системе PlantScreen™ (Исследовательский центр PSI, Драшов, Чешская Республика).

Анализ появления и анализ in-vitro были проведены на платформе OloPhen XYZ (Центр биотехнологических и сельскохозяйственных исследований региона Хана, Оломоуц). Эти два анализа были использованы для первоначального скрининга большего набора веществ в диапазоне концентраций применения и в различных условиях. С помощью двух первоначальных анализов мы стремились выбрать наиболее перспективные кандидаты PH´s и лучшие дозы применения для второго этапа углубленной морфо-физиологической характеристики действия выбранных веществ в культурных растениях. Вкратце, при анализе всходов семена пшеницы, покрытые 6 различными биостимуляторами в возрастающей концентрации, высевались в почву, насыщенную либо водопроводной, либо обогащенной солями водой, и скорость их всходов и рост отслеживались в течение 12 дней с помощью RGB-камеры. Для второго испытания, анализа in-vitro, 4-дневные проростки Arabidopsis thaliana выращивались в течение 8 дней в 48-луночных планшетах, содержащих среду, обогащенную 13 различными биостимуляторами в возрастающих концентрациях, в условиях контроля или солевого стресса. RGB-снимки каждой пластины делались дважды в день в течение всего эксперимента. Увеличение зеленой площади, относительная скорость роста и выживаемость в условиях солевого стресса были использованы для расчета индекса характеристики биостимуляторов растений (PBC) (3), чтобы определить вещества, которые ведут себя как улучшители роста и/или смягчители стресса. Наиболее эффективные вещества были отобраны для второго этапа скрининга на листовых культурах, проведенного в Исследовательском центре PSI. Здесь мы представляем первые результаты для одного из веществ, охарактеризованного в первоначальном анализе как соединение, смягчающее стресс (рис. 2). Растения салата выращивали в течение 35 дней в контролируемых условиях и поливали каждый второй день либо питательным раствором, либо раствором 80 мМ NaCl. Биостимулятор применялся дважды в неделю в виде внекорневого опрыскивания. Рост растений оценивался динамически в течение всего периода развития и при внесении соли (рис.2A). Показатели роста улучшились у растений, выращенных в солевых условиях и опрысканных биостимулятором (рис. 2B,C), что коррелировало с живым весом растений, определенным в конце опыта (рис. 2D), что окончательно подтверждает, что выбранное вещество действует как средство для снятия стресса.

data-src="/wp-content/themes/yootheme/cache/Picture2-d48f481d.webp"

Рис.2| Неинвазивный фенотипический анализ на основе изображений контрольных и обработанных PH´s растений латука, выращенных в контрольных условиях или в условиях солевого стресса с помощью компактной системы ^{PlantScreenTM}. (A) Цветные сегментированные изображения растений салата-латука с видом сверху, красный-зеленый-синий (RGB) в течение периода фенотипирования, с^10-го по ^31-й день после стратификации (DAS). (B) Прогнозируемая площадь побегов растений салата-латука, выращенных в контрольных условиях или условиях солевого стресса и подвергнутых обработке биостимулятором. Значения выражены в ^мм2 и представляют собой среднее значение десяти биологических реплик на обработку ± стандартное отклонение. (C) Прогнозируемая площадь побегов растений салата-латука в последний день фенотипирования. Значения представляют собой среднее значение десяти биологических реплик на обработку. Планки ошибок представляют стандартное отклонение. (D) Свежий вес побегов латука, собранных после окончания периода фенотипирования (31 ДАС). Значения представляют собой среднее значение десяти биологических реплик для каждой обработки. Планки ошибок представляют стандартное отклонение.

Учитывая полученные многообещающие результаты, мы будем изучать принцип действия более широкого набора биостимуляторов, отобранных из первоначального скрининга in vitro, и охарактеризуем их активность на листовых и плодоносящих культурах, салате и томатах соответственно.

В целом, представленные здесь предварительные данные показывают, что высокопроизводительное автоматизированное фенотипирование оказалось мощным инструментом, позволяющим отслеживать характеристики растений на протяжении всей их жизни, на всех стадиях развития, выделять морфо-физиологические признаки, связанные со стрессом и применением биостимуляторов, и исследовать способ действия веществ. Точная и достоверная оценка фенотипических переменных имеет решающее значение для характеристики и количественного определения биостимулирующей активности различных продуктов, выбранных в качестве предполагаемых стимуляторов роста и/или смягчителей стресса. Технологии высокопроизводительного фенотипирования, которые постепенно привлекают все больше внимания для целей скрининга и разработки продуктов, в будущем могут обеспечить очень эффективные по времени и стоимости средства для скрининга новых веществ, оптимальных доз, правильного времени применения и способа действия соединений с биостимулирующей активностью.

Благодарности

Работа выполнена при поддержке программы исследований и инноваций Европейского Союза "Горизонт 2020" в рамках гранта Марии 826 Склодовской-Кюри № 675006, проекта PHOBOS Prot. 2017FYBLPP и Czech Plant Phenotyping Network (CzPPN).

Ссылки:

Высокопроизводительное автоматизированное фенотипирование как кратчайший путь к более эффективным биостимуляторам: От семян к культурам

.

ПОДПИСАТЬСЯ

ЗАПИСИ В БЛОГАХ

ПОДКАСТ

ВЕБИНАР

YOUTUBE