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Le phénotypage automatisé à haut débit, un raccourci vers des biostimulants plus efficaces : Des semences aux cultures

Par : Mirella Sorrentino1,4, Nuria de Diego2, Giuseppe Colla3, Lukáš Spíchal2, Youssef Rouphael4 et Klára Panzarová1,*
*email: panzarova@psi.cz

1PSI(Photon Systems Instruments), spol. s r.o., Drasov, République tchèque

2-Départementde biologie chimique et de génétique, Centre de la région Haná pour la recherche biotechnologique et agricole, Faculté des sciences, Université Palacký, Olomouc, République tchèque.

3 Département des sciences agricoles et forestières, Université de Tuscia, via San Camillo De Lellis snc, 01100 Viterbo, Italie

 4Département d'agriculture, Université de Naples Federico II, via Università 100, 80055 Portici (NA), Italie.

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Le développement de biostimulants hautement efficaces nécessite une évaluation précise des effets des produits candidats sur les caractéristiques morpho-physiologiques des cultures sélectionnées à différents stades de développement et dans différentes conditions environnementales. Comme les méthodes de criblage conventionnelles prennent du temps, sont destructives et demandent beaucoup de travail, des procédures de phénotypage des plantes à haut débit ont récemment été proposées comme outils efficaces et de haute précision pour le criblage de nouveaux produits. Les systèmes de phénotypage des plantes sont des systèmes robotisés entièrement automatisés, généralement installés dans un environnement contrôlé ou dans des conditions de serre semi-contrôlée. Les plates-formes de phénotypage sont conçues pour assurer non seulement un suivi non invasif des plantes par imagerie, avec un débit de quelques plantes à plusieurs centaines, mais aussi pour fournir des moyens de culture et de manipulation automatisés des plantes, tels que des unités automatisées d'arrosage/de pesée, d'apport de nutriments ou de pulvérisation (1, 2). Les plantes peuvent être notées de manière dynamique pour de nombreux traits morpho-physiologiques et biochimiques liés à la croissance, au rendement et à la performance tout au long de leur développement ou de l'apparition, de la progression et de la récupération après un stress abiotique. Cette approche permet donc la caractérisation fonctionnelle des biostimulants in planta avec une grande précision et une haute résolution dans une phase donnée du développement de la plante et/ou de la réponse de la plante aux conditions environnementales.

L'approche dite de phénotypage intégratif dans des plateformes de phénotypage multi-sensorielles a été récemment utilisée pour étudier avec succès le mode d'action des biostimulants et individualiser les traits morpho-physiologiques liés au stress et aux applications des biostimulants (2,3,4). Le large éventail de caractéristiques peut être décrit quantitativement et différencié qualitativement en incluant des capteurs d'imagerie non seulement pour l'imagerie visible (imagerie RVB) et/ou l'imagerie 3D, mais aussi pour la spectroscopie d'imagerie (imagerie hyperspectrale), l'imagerie infrarouge thermique et l'imagerie de fluorescence chlorophyllienne. L'imagerie RVB est utilisée pour estimer la couleur réelle de chaque pixel et, à l'aide d'algorithmes de traitement d'image, pour identifier les pixels d'origine végétale. Pour les objets végétaux identifiés, les caractéristiques morphologiques et géométriques sont quantifiées, y compris les propriétés de couleur. L'évaluation du volume de la plante ou de la surface foliaire totale, basée sur le nombre de pixels, est en corrélation avec le poids frais et sec de la biomasse végétale aérienne. La croissance des plantes peut être saisie dans des mesures de séries temporelles qui sont nécessaires pour suivre la progression de la dynamique de croissance sur des plantes individuelles dans une phase donnée de développement et/ou de réponse au stress. L'architecture et la forme précises des plantes, telles que la hauteur, la taille des feuilles individuelles ou la biomasse, peuvent être quantifiées en utilisant la technologie d'imagerie 3D. Outre la caractérisation structurelle et morphologique, les plates-formes de phénotypage automatisées se caractérisent par des capteurs conçus pour le phénotypage dit physiologique. L'imagerie cinétique de la fluorescence chlorophyllienne (ChlF) est utilisée pour quantifier la capacité photosynthétique des plantes et leur aptitude à récolter l'énergie lumineuse. La ChlF est une technique populaire en physiologie végétale, utilisée pour la mesure rapide et non invasive de l'activité du photosystème II (PSII). L'activité du PSII est très sensible à une série de facteurs biotiques et abiotiques, c'est pourquoi la technique de fluorescence chlorophyllienne est utilisée comme un indicateur rapide de la performance photosynthétique des plantes à différents stades de développement et/ou en réponse à un environnement changeant. L'avantage des mesures de la fluorescence chlorophyllienne par rapport à d'autres méthodes de surveillance des stress est que les changements des paramètres cinétiques de la fluorescence chlorophyllienne se produisent souvent avant que les autres effets du stress ne soient apparents. En outre, l'imagerie thermique est une technique très sensible utilisée pour mesurer la conductance stomatique et les taux de transpiration de l'eau des plantes par la quantification de la température des feuilles et de la canopée. L'imagerie thermique des feuilles est importante pour évaluer les réponses des plantes à la charge thermique et à la privation d'eau. Enfin, la technologie d'imagerie hyperspectrale peut être utilisée pour quantifier les profils de réflectance spectrale des plantes et caractériser les propriétés biochimiques des plantes par une technologie non destructive basée sur l'image. Les images hyperspectrales peuvent être utilisées pour calculer une gamme d'indices de réflexion sur toute la surface de la plante, en se référant à la composition pigmentaire de la plante, au statut de l'azote ou à la teneur en eau des plantes.

Nous présentons ici un exemple de la manière dont l'approche intégrative du phénotypage peut être appliquée au criblage d'hydrolysats de protéines (PH) d'origine végétale, récemment formulés et commerciaux. L'ensemble des PHs a été criblé pour leur fonction putative de promotion de la croissance et/ou d'atténuation du stress sur des plantes soumises à un stress abiotique (salinité) à différents stades phénologiques. En utilisant deux plateformes automatisées de phénotypage PlantScreenTM développées par PSI (Photon Systems Instruments, Czechia), nous avons pu suivre le mode d'action des PHs sélectionnés en utilisant différents modes d'application sur différentes espèces de plantes et criblées à différents stades phénologiques. Les PHs ont été appliqués par 1) enrobage des graines, 2) dans les milieux de culture ou 3) par pulvérisation foliaire. Les effets des PHs ont été évalués en quantifiant 1) le taux d'émergence des semis de blé, 2) les traits liés à la croissance de la rosette chez Arabidopsis et 3) un ensemble de traits morpho-physiologiques chez les plantes de laitue et de tomate (Fig.1). Le mode d'action biostimulant des PHs a été caractérisé par une analyse quantitative de la performance photosynthétique, de la dynamique de croissance et de l'analyse des couleurs.

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Fig.1| Pipeline de criblage à haut débit pour la caractérisation fonctionnelle des PHs. Le mode d'action des biostimulants est quantifié chez différentes espèces végétales à travers un ensemble de stades de développement et en utilisant différents modes d'application des biostimulants dans le système modulaire PlantScreen™ (Centre de recherche PSI, Drasov, République tchèque).

L'essai d'émergence et l'essai in vitro ont été réalisés dans la plateforme OloPhen XYZ (Centre de la région Haná pour la recherche biotechnologique et agricole, Olomouc). Les deux tests ont été utilisés pour le criblage initial d'un ensemble plus large de substances dans une gamme de concentrations d'application et dans différentes conditions. En utilisant les deux essais initiaux, nous avons cherché à sélectionner les PH candidats les plus prometteurs et les meilleures doses d'application pour la deuxième phase de caractérisation morpho-physiologique approfondie du mode d'action des substances sélectionnées dans les plantes cultivées. En bref, dans l'essai d'émergence, des graines de blé enrobées de 6 biostimulants différents à des concentrations croissantes ont été semées dans un sol saturé d'eau du robinet ou d'eau enrichie en sel et leur taux d'émergence et leur croissance ont été suivis pendant 12 jours à l'aide d'une caméra RVB. Pour le deuxième essai, le test in vitro, des plantules d'Arabidopsis thaliana âgées de 4 jours ont été cultivées pendant 8 jours dans des plaques à 48 puits contenant un milieu enrichi de 13 biostimulants différents à des concentrations croissantes, dans des conditions de contrôle ou de stress salin. Une photo RVB de chaque plaque a été prise deux fois par jour pendant toute la durée de l'expérience. L'augmentation de la surface verte, le taux de croissance relatif et le taux de survie dans des conditions salines ont été utilisés pour calculer l'indice de caractérisation des biostimulants végétaux (PBC) (3) afin d'identifier les substances se comportant comme des améliorateurs de croissance et/ou des atténuateurs de stress. Les substances les plus performantes ont été sélectionnées pour la deuxième phase de criblage des cultures feuillues réalisée au centre de recherche du PSI. Nous présentons ici les premiers résultats pour l'une des substances caractérisées dans le test initial comme un composé atténuant le stress (Fig.2). Les plantes de laitue ont été cultivées pendant 35 jours dans des conditions contrôlées et ont été arrosées tous les deux jours soit avec une solution nutritive soit avec une solution de NaCl 80 mM. Le biostimulant a été appliqué deux fois par semaine en pulvérisation foliaire. La croissance des plantes a été quantifiée dynamiquement tout au long du développement et de l'imposition du sel (Fig.2A). La performance de croissance a été améliorée dans les plantes cultivées en milieu salin et pulvérisées avec le biostimulant (Fig. 2B,C), ce qui a été corrélé avec le poids frais des plantes quantifié à la fin de l'essai (Fig.2D), confirmant finalement que la substance sélectionnée agit comme un atténuateur de stress.

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Fig.2| Analyse phénotypique non invasive, basée sur l'image, de plants de laitue témoins et traités au PH, cultivés dans des conditions de contrôle ou de stress salin, à l'aide du système PlantScreenTM Compact. (A) Images Red Green Blue (RGB) en vue de dessus, segmentées en couleur, des plantes de laitue pendant la période de phénotypage, du10ème au31ème jour après stratification (DAS). (B) Surface projetée des pousses des plantes de laitue cultivées dans des conditions de contrôle ou de stress salin et soumises à un traitement par biostimulant. Les valeurs sont exprimées en mm2 et représentent la moyenne de dix répétitions biologiques par traitement ± l'écart-type. (C) Surface projetée des pousses des plants de laitue le dernier jour du phénotypage. Les valeurs représentent la moyenne de dix répétitions biologiques par traitement. Les barres d'erreur représentent l'écart-type. (D) Poids frais des pousses de laitue récoltées après la fin de la période de phénotypage (31 DAS). Les valeurs représentent la moyenne de dix réplicats biologiques par traitement. Les barres d'erreur représentent l'écart-type.

Compte tenu des résultats prometteurs obtenus, nous étudierons ensuite le mode d'action d'un ensemble plus large de biostimulants sélectionnés à partir du premier criblage in vitro et nous caractériserons leur activité sur des cultures à feuilles et à fruits, respectivement la laitue et la tomate.

En résumé, les données préliminaires présentées ici montrent que le phénotypage automatisé à haut débit s'est avéré être un outil puissant, nous permettant de suivre la performance de la plante tout au long de sa vie, à tous les stades de développement, d'individualiser les traits morpho-physiologiques liés aux applications de stress et de biostimulants et d'étudier le mode d'action des substances. Une évaluation précise et exacte des variables phénotypiques est essentielle pour caractériser et quantifier l'activité biostimulante de divers produits sélectionnés comme améliorateurs de croissance et/ou atténuateurs de stress. Les technologies de phénotypage à haut débit, qui font l'objet d'une attention croissante pour le criblage et le développement de produits, pourraient à l'avenir fournir des moyens très efficaces en termes de temps et de coûts pour cribler de nouvelles substances, des doses optimales, le bon moment d'application et le mode d'action des composés ayant des activités biostimulantes.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par le programme de recherche et d'innovation Horizon 2020 de l'Union européenne dans le cadre de la convention de subvention Marie 826 Skłodowska-Curie n° 675006, du projet PHOBOS Prot. 2017FYBLPP et le réseau tchèque de phénotypage des plantes (CzPPN).

Références :

  1. Rouphael Y, Spíchal L, Panzarová K, Casa R et Colla G (2018). Phénotypage des plantes à haut débit pour le développement de nouveaux biostimulants : Du laboratoire au champ ou du champ au laboratoire ? Front. Plant Sci. 9:1197. doi : 10.3389/fpls.2018.01197.
  2. De Diego N, Fürst T, Humplík JF, Ugena L, Podlešáková K et Spíchal L (2017). Une méthode automatisée pour le criblage à haut débit de la croissance des rosettes d'Arabidopsis dans des plaques multi-puits et sa validation en conditions de stress. Front. Plant Sci. 8:1702. doi : 10.3389/fpls.2017.01702
  3. Ugena L, Hýlová A, Podlešáková K, Humplík JF, Doležal K, De Diego N et Spíchal L (2018). Caractérisation du mode d'action des biostimulants à l'aide d'un nouveau criblage multi-traits à haut débit de la germination et de la croissance des rosettes d'Arabidopsis. Front. Plant Sci. 9:1327. doi : 10.3389/fpls.2018.01327
  4. Paul K, Sorrentino M, Lucini L, Rouphael Y, Cardarelli M, Bonini P, Reynaud H, Canaguier R, Trtílek M, Panzarová K et Colla G (2019). Comprendre l'action biostimulante des hydrolysats de protéines d'origine végétale par le phénotypage végétal à haut débit et la métabolomique : Une étude de cas sur la tomate. Front. Plant Sci. 10:47. doi : 10.3389/fpls.2019.00047

 

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