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高通量自动表型是获得更有效生物刺激剂的捷径。从种子到作物

By:Mirella Sorrentino1,4, Nuria deDiego2, GiuseppeColla3, Lukáš Spíchal2, YoussefRouphael4and Klára Panzarová1,*
*email: panzarova@psi.cz

1PSI(Photon Systems Instruments), spol. s r.o., Drasov, Czech Republic

2.化学生物学和遗传学系，哈纳地区生物技术和农业研究中心，帕拉茨基大学理学院，捷克，奥洛穆茨。

3 托斯卡纳大学农业和森林科学系，via San Camillo De Lellis snc, 01100 Viterbo, Italy

 4.那不勒斯费德里科二世大学农业系，via Università 100, 80055 Portici (NA), Italy

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开发高效的生物刺激剂需要准确评估候选产品在不同发育阶段和环境条件下对选定作物的形态生理性状的影响。由于传统的筛选方法是耗时的、破坏性的和劳动密集型的，最近提出了高通量的植物表型程序作为新产品筛选的有效和高精度工具。植物表型分析系统是全自动的机器人系统，通常安装在受控环境或半受控温室条件下。表型分析平台的设计不仅可以确保对植物进行非侵入性的图像监测，其产量可达几百株，而且还可以提供自动培养和处理植物的手段，如自动浇水/称重、营养液输送或喷洒装置（1，2）。在植物的整个发育过程中，或者在非生物胁迫的发生、发展和恢复过程中，可以对与生长、产量和性能有关的许多形态生理和生物化学特征进行动态评分。因此，这种方法可以在植物发育的特定阶段和/或植物对环境条件的反应中，在平面上进行高精度和高分辨率的生物刺激剂功能特征分析。

所谓的多传感器表型平台的综合表型方法最近已被用来成功地研究生物刺激剂的作用方式，并区分与压力和生物刺激剂应用相关的形态生理特征（2,3,4）。通过成像传感器，不仅可以对可见光成像（RGB成像）和/或三维成像，还可以对成像光谱（高光谱成像）、热红外成像和叶绿素荧光成像进行定量描述和定性区分。RGB成像用于估计每个像素的真实颜色，并通过使用图像处理算法来识别植物来源的像素。对于识别的植物对象，形态和几何特征被量化，包括颜色属性。基于像素数的植物体积或总叶面积的评估与地上植物生物量的鲜重和干重相关。植物的生长可以通过时间序列测量来捕捉，这对于跟踪单个植物在特定发育阶段和/或压力反应中的生长动态进展是必要的。植物的精确结构和形状，如高度、单个叶片大小或生物量，可以通过使用三维成像技术进行量化。除了结构和形态特征外，自动表型平台的关键特征是为所谓的生理表型设计的传感器。动力叶绿素荧光（ChlF）成像被用来量化植物的光合作用能力和收集光能的能力。ChlF是植物生理学中一项流行的技术，用于快速非侵入性地测量光系统II（PSII）的活性。PSII活性对一系列生物和非生物因素非常敏感，因此叶绿素荧光技术被用作植物在不同发育阶段和/或对环境变化的反应的快速指标。与其他监测压力的方法相比，叶绿素荧光测量的优点是叶绿素荧光动力学参数的变化往往在压力的其他影响显现之前就已经发生了。此外，热成像是非常敏感的技术，用于通过叶片和树冠温度的量化来测量植物的气孔传导和水分蒸腾率。叶子的热成像对于评估植物对热负荷和水剥夺的反应非常重要。最后，高光谱成像技术可用于量化植物的光谱反射率曲线，并通过非破坏性的图像技术对植物的生化特性进行描述。高光谱图像可用于计算整个植物表面的反射指数范围，指的是植物的色素组成、氮素状态或植物的水含量。

在此，我们提出了一个例子，说明如何将综合表型方法应用于筛选新配方和商业化的植物源性蛋白水解物（PHs）。这套PHs被筛选出来，以确定其在不同表观阶段受到非生物胁迫（盐度）的植物上所具有的促进生长和/或减轻胁迫的功能。利用PSI（Photon Systems Instruments，捷克）开发的两个自动PlantScreenTM表型平台，我们能够通过在不同的 植物物种 中使用不同的应用模式来监测所选PHs的作用方式，并在不同的物候期进行筛选。PHs的应用方式有：1）种子包衣；2）生长介质；3）叶面喷洒。PHs的影响是通过量化1）小麦的出苗率，2）拟南芥的莲座生长相关性状和3）莴苣和番茄植物的一系列形态生理性状来评估的（图1）。PHs生物刺激剂的作用方式是通过对光合作用性能、生长动态和颜色分析的定量分析来描述的。

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图1：用于PHs功能鉴定的高通量筛选管道。在PlantScreen™模块化系统（PSI研究中心，捷克德拉索夫）中，通过使用不同的生物刺激剂应用模式，对不同植物物种的作用模式进行量化。

在OloPhen XYZ平台（Olomouc的Haná地区生物技术和农业研究中心），进行了萌发试验和体外试验。这两种检测方法用于在不同的应用浓度范围和不同的条件下对较大的一组物质进行初步筛选。利用这两个初步试验，我们旨在选择最有前途的候选PHs和最佳应用剂量，以便对所选物质在作物植物中的形态生理作用模式进行第二阶段的深入研究。简而言之，在出苗试验中，将涂有6种不同浓度的生物刺激剂的小麦种子播种在自来水或富含盐分的饱和土壤中，用RGB照相机监测它们的出苗率和生长情况，为期12天。对于第二项试验，即体外试验，4天大的拟南芥幼苗在48孔板中生长8天，该板含有富含13种不同浓度的生物刺激剂的培养基，在控制或盐胁迫条件下生长。在整个实验过程中，每天对每个平板拍摄两次RGB图片。绿色面积的增加、相对生长率和盐分条件下的存活率被用来计算植物生物刺激剂特性指数（PBC）（3），以确定作为生长改良剂和/或压力缓解剂的物质。在PSI研究中心进行的叶类作物第二阶段筛选中，选择了表现最好的物质。在此，我们介绍了在初始试验中被描述为压力缓解化合物的物质之一的第一个结果（图2）。生菜植株在受控条件下生长了35天，每隔一天用营养液或80mM的氯化钠溶液浇灌。生物刺激剂每周进行两次叶面喷洒。在整个生长过程中，对植物的生长进行动态量化，并施加盐分（图2A）。喷洒了生物刺激剂的盐生植物的生长性能得到了改善（图2B,C），这与试验结束时量化的植物鲜重相关（图2D），最终证实了所选物质作为一种压力缓解剂的作用。

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图2： 使用PlantScreenTMCompact系统对在控制或盐胁迫条件下生长的对照和PH´s处理的生菜植株进行非侵入性的图像表型分析。(A) 生菜植株在表型分析期间（从分层后第10天到第31天）的红绿蓝（RGB）彩色分割图像。 (B) 在控制或盐胁迫条件下栽培的生菜植株经生物刺激剂处理后的预测芽面积。数值以mm2表示，代表每个处理的10个生物重复的平均值±标准偏差。(C) 在表型的最后一天，生菜植株的预测芽面积。数值代表每个处理的十个生物重复的平均值。误差条代表标准偏差。(D) 表型期结束后收获的莴苣芽的鲜重（31DAS）。数值代表每个处理的十个生物重复的平均值。误差条代表标准偏差。

鉴于所获得的有希望的结果，我们接下来将研究从最初的体外筛选中选出的一套更广泛的生物刺激剂的作用方式，并将分别描述它们在叶类和果类作物、莴苣和番茄植物中的活性。

总之，这里提出的初步数据表明，高通量自动表型被证明是一个强大的工具，使我们能够在植物的整个生命过程中，在所有的发育阶段跟踪其表现，将与压力和生物刺激剂应用有关的形态生理特征独立出来，并研究物质的作用方式。对表型变量进行精确和准确的评估，对于描述和量化被选为假定的生长改良剂和/或压力缓解剂的各种产品的生物刺激剂活性至关重要。高通量表型技术在产品筛选和开发方面正逐渐受到关注，未来可能会提供非常有效的时间和成本手段来筛选新型物质、最佳剂量、正确的应用时间以及具有生物刺激剂活性的化合物的作用方式。

鸣谢

这项工作得到了欧盟地平线2020研究和创新计划的支持，该计划由Marie 826 Skłodowska-Curie拨款协议No 675006、PHOBOS项目Prot.2017FYBLPP和捷克植物表型网络（CzPPN）。

参考文献。

  1. Rouphael Y, Spíchal L, Panzarová K, Casa R和Colla G（2018）。用于开发新型生物刺激物的高通量植物表型。从实验室到田间还是从田间到实验室？Front.9:1197.DOI: 10.3389/fpls.2018.01197
  2. De Diego N, Fürst T, Humplík JF, Ugena L, Podlešáková K and Spíchal L (2017).一种在多孔板中高通量筛选拟南芥玫瑰生长的自动方法及其在压力条件下的验证。Front.8:1702. DOI: 10.3389/fpls.2017.01702
  3. Ugena L, Hýlová A, Podlešáková K, Humplík JF, Doležal K, De Diego N and Spíchal L (2018).利用拟南芥发芽和玫瑰花生长的新型多性状高通量筛选对生物刺激剂的作用方式进行表征。Front.9:1327。DOI: 10.3389/fpls.2018.01327
  4. Paul K, Sorrentino M, Lucini L, Rouphael Y, Cardarelli M, Bonini P, Reynaud H, Canaguier R, Trtílek M, Panzarová K和Colla G（2019年）。通过高通量植物表型和代谢组学了解植物来源的蛋白水解物的生物刺激作用。关于番茄的案例研究。Front.10:47. doi: 10.3389/fpls.2019.00047

 

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