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Fenotipado automatizado de alto rendimiento como atajo hacia bioestimulantes más eficaces: De las semillas a los cultivos

Por: Mirella Sorrentino1,4, Nuria de Diego2, Giuseppe Colla3, Lukáš Spíchal2, Youssef Rouphael4 y Klára Panzarová1,*
*email: panzarova@psi.cz

1PSI(Photon Systems Instruments), spol. s r.o., Drasov, República Checa

2Departamentode Biología Química y Genética, Centro de la Región Haná para la Investigación Biotecnológica y Agrícola, Facultad de Ciencias, Universidad Palacký, Olomouc, Chequia.

3 Departamento de Agricultura y Ciencias Forestales, Universidad de Tuscia, via San Camillo De Lellis snc, 01100 Viterbo, Italia

 4Departamentode Agricultura, Universidad de Nápoles Federico II, via Università 100, 80055 Portici (NA), Italia

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El desarrollo de bioestimulantes altamente eficaces requiere una evaluación precisa de los efectos de los productos candidatos sobre los rasgos morfofisiológicos de los cultivos seleccionados durante diferentes etapas de desarrollo y condiciones ambientales. Dado que los métodos convencionales de cribado requieren mucho tiempo, son destructivos y requieren mucha mano de obra, recientemente se han propuesto procedimientos de fenotipado de plantas de alto rendimiento como herramientas eficaces y de alta precisión para el cribado de nuevos productos. Los sistemas de fenotipado de plantas son sistemas robóticos totalmente automatizados que suelen instalarse en un entorno controlado o en condiciones semicontroladas de invernadero. Las plataformas de fenotipado están diseñadas para garantizar no sólo un seguimiento no invasivo de las plantas basado en imágenes, con un rendimiento de unos pocos a varios cientos de plantas, sino que también proporcionan medios para el cultivo automatizado y la manipulación de las plantas, como el riego/pesaje automatizado, el suministro de nutrientes o las unidades de pulverización (1, 2). Las plantas pueden ser puntuadas dinámicamente para muchos rasgos morfofisiológicos y bioquímicos relacionados con el crecimiento, el rendimiento y el desempeño a lo largo de su desarrollo o inicio, progresión y recuperación del estrés abiótico. Este enfoque permite, por tanto, la caracterización funcional de bioestimulantes en planta con gran precisión y alta resolución en una fase determinada del desarrollo de la planta y/o de la respuesta de la planta a las condiciones ambientales.

El denominado enfoque de fenotipado integrador en plataformas de fenotipado multisensorial se ha utilizado recientemente para investigar con éxito el modo de acción de los bioestimulantes e identificar los rasgos morfofisiológicos relacionados con el estrés y las aplicaciones de los bioestimulantes (2,3,4). El amplio espectro de rasgos puede describirse cuantitativamente y diferenciarse cualitativamente mediante la inclusión de sensores de imágenes no sólo para imágenes visibles (imágenes RGB) y/o imágenes 3D, sino también para espectroscopia de imágenes (imágenes hiperespectrales), imágenes infrarrojas térmicas e imágenes de fluorescencia de clorofila. Las imágenes RGB se utilizan para estimar el color real de cada píxel y, mediante algoritmos de procesamiento de imágenes, para la identificación de píxeles derivados de plantas. Para los objetos vegetales identificados, se cuantifican las características morfológicas y geométricas, incluidas las propiedades del color. La evaluación basada en el número de píxeles del volumen de la planta o el área foliar total se correlaciona con el peso fresco y seco de la biomasa de la planta sobre el suelo. El crecimiento de las plantas puede capturarse en mediciones de series temporales que son necesarias para seguir la progresión de la dinámica de crecimiento en plantas individuales en una fase determinada de desarrollo y/o respuesta al estrés. La arquitectura y la forma precisas de las plantas, como la altura, el tamaño individual de las hojas o la biomasa, pueden cuantificarse utilizando tecnología de imágenes en 3D. Además de la caracterización estructural y morfológica, una característica clave de las plataformas automatizadas de fenotipado son los sensores diseñados para el denominado fenotipado fisiológico. La imagen cinética de fluorescencia de clorofila (ChlF ) se utiliza para cuantificar la capacidad fotosintética de las plantas y su habilidad para cosechar energía luminosa. La ChlF es una técnica muy utilizada en fisiología vegetal para medir de forma rápida y no invasiva la actividad del fotosistema II (PSII). La actividad del PSII es muy sensible a una serie de factores bióticos y abióticos y, por lo tanto, la técnica de fluorescencia de la clorofila se utiliza como indicador rápido del rendimiento fotosintético de las plantas en diferentes fases de desarrollo y/o en respuesta a un entorno cambiante. La ventaja de las medidas de fluorescencia de la clorofila sobre otros métodos para monitorizar el estrés es que los cambios en los parámetros cinéticos de fluorescencia de la clorofila a menudo ocurren antes de que otros efectos del estrés sean aparentes. Además, las imágenes térmicas son una técnica muy sensible utilizada para medir la conductancia estomática y las tasas de transpiración de agua de las plantas mediante la cuantificación de la temperatura de la hoja y del dosel. Las imágenes térmicas de las hojas son importantes para evaluar la respuesta de las plantas a la carga térmica y a la falta de agua. Por último, la tecnología de imágenes hiperespectrales puede utilizarse para cuantificar los perfiles de reflectancia espectral de las plantas y caracterizar sus propiedades bioquímicas mediante una tecnología no destructiva basada en imágenes. Las imágenes hiperespectrales pueden utilizarse para calcular una serie de índices de reflectancia en toda la superficie de la planta que hacen referencia a la composición pigmentaria de la planta, al estado del nitrógeno o al contenido de agua de las plantas.

Aquí presentamos un ejemplo de cómo el enfoque de fenotipado integrador puede aplicarse al cribado de hidrolizados proteicos (PHs) de nueva formulación y comerciales derivados de plantas. El conjunto de PHs fue examinado por su putativo crecimiento de promoción y / o la función de aliviar el estrés en las plantas sometidas a un estrés abiótico (salinidad) en diferentes etapas fenológicas. Utilizando dos plataformas automatizadas de fenotipado PlantScreenTM desarrolladas por PSI (Photon Systems Instruments, Czechia), pudimos monitorizar el modo de acción de los PHs seleccionados utilizando diferentes modos de aplicación en diferentes especies de plantas y examinadas en diferentes estados fenológicos. Los PHs se aplicaron por 1) recubrimiento de semillas, 2) en medios de cultivo o 3) por pulverización foliar. Los efectos de los PHs se evaluaron mediante la cuantificación de 1) la tasa de emergencia de plántulas de trigo, 2) rasgos relacionados con el crecimiento de la roseta en Arabidopsis y 3) conjunto de rasgos morfo-fisiológicos en plantas de lechuga y tomate (Fig.1). El modo de acción bioestimulante de los PHs se caracterizó mediante el análisis cuantitativo del rendimiento fotosintético, la dinámica de crecimiento y el análisis del color.

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Fig.1| Proceso de cribado de alto rendimiento para la caracterización funcional de los PHs. El modo de acción de los bioestimulantes se cuantifica en diferentes especies de plantas a través de un conjunto de etapas de desarrollo y mediante el uso de diferentes modos de aplicación de bioestimulantes en el Sistema Modular PlantScreen™ (Centro de Investigación PSI, Drasov, República Checa).

El ensayo de emergencia y el ensayo in vitro se realizaron en la Plataforma OloPhen XYZ (Centro de la Región Haná para la Investigación Biotecnológica y Agrícola, Olomouc). Los dos ensayos se utilizaron para el cribado inicial de un conjunto más amplio de sustancias en un rango de concentraciones de aplicación y en diferentes condiciones. Utilizando los dos ensayos iniciales, nuestro objetivo era seleccionar los PH candidatos más prometedores y las mejores dosis de aplicación para la segunda fase de caracterización en profundidad del modo de acción morfofisiológico de las sustancias seleccionadas en las plantas de cultivo. Brevemente, en el ensayo de emergencia se sembraron semillas de trigo recubiertas con 6 bioestimulantes diferentes en concentraciones crecientes en suelo saturado con agua del grifo o enriquecida con sal y se monitorizó su tasa de emergencia y su crecimiento durante 12 días utilizando una cámara RGB. Para la segunda prueba, el ensayo in vitro, se cultivaron plántulas de Arabidopsis thaliana de 4 días de edad durante 8 días en placas de 48 pocillos que contenían un medio enriquecido con 13 bioestimulantes diferentes en concentraciones crecientes, ya fuera en condiciones de control o de estrés salino. Se tomó una imagen RGB de cada placa dos veces al día durante todo el experimento. El aumento del área verde, la tasa de crecimiento relativo y la tasa de supervivencia en condiciones salinas se utilizaron para calcular el Índice de Caracterización de Bioestimulantes Vegetales (PBC) (3) con el fin de identificar las sustancias que se comportaban como mejoradores del crecimiento y/o aliviadores del estrés. Las sustancias con mejores resultados se seleccionaron para la segunda fase de cribado en cultivos de hoja realizada en el Centro de Investigación del PSI. Aquí presentamos los primeros resultados de una de las sustancias caracterizadas en el ensayo inicial como compuesto aliviador del estrés (Fig.2). Las plantas de lechuga se cultivaron durante 35 días en condiciones controladas y se regaron cada dos días con una solución nutriente o con una solución de NaCl 80 mM. El bioestimulante se aplicó dos veces por semana como pulverización foliar. El crecimiento de las plantas se cuantificó dinámicamente a lo largo del desarrollo y la imposición de sal (Fig.2A). El rendimiento del crecimiento mejoró en las plantas cultivadas en sal rociadas con el bioestimulante (Fig. 2B,C), lo que se correlacionó con el peso fresco de las plantas cuantificado al final del ensayo (Fig.2D) confirmando finalmente que la sustancia seleccionada actúa como un aliviador del estrés.

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Fig.2| Análisis fenotípico no invasivo basado en imágenes de plantas de lechuga de control y tratadas con PH cultivadas en condiciones de control o de estrés salino utilizando el sistema PlantScreenTM Compact. (A) Vista superior segmentada en color Rojo Verde Azul (RGB) de las plantas de lechuga durante el periodo de fenotipado, del10º al31º día después de la estratificación (DAS). (B) Área proyectada de brotes de plantas de lechuga cultivadas en condiciones de control o de estrés salino y sometidas a tratamiento con bioestimulantes. Los valores se expresan en mm2 y representan la media de diez réplicas biológicas por tratamiento ± desviación estándar. (C) Área proyectada de brotes de plantas de lechuga en el último día de fenotipado. Los valores representan la media de diez réplicas biológicas por tratamiento. Las barras de error representan la desviación estándar. (D) Peso fresco de los brotes de lechuga cosechados tras el final del periodo de fenotipado (31 DAS). Los valores representan la media de diez réplicas biológicas por tratamiento. Las barras de error representan la desviación estándar.

Dados los prometedores resultados obtenidos, a continuación investigaremos el modo de acción de un conjunto más amplio de bioestimulantes seleccionados a partir del cribado inicial in vitro y caracterizaremos su actividad en cultivos de hoja y frutales, lechugas y tomateras respectivamente.

En resumen, los datos preliminares presentados aquí muestran que el fenotipado automatizado de alto rendimiento demostró ser una herramienta poderosa, que nos permite seguir el rendimiento de la planta a lo largo de su vida, en todas las etapas de desarrollo, individualizar los rasgos morfofisiológicos relacionados con el estrés y las aplicaciones de bioestimulantes e investigar el modo de acción de las sustancias. La evaluación precisa y exacta de las variables fenotípicas es fundamental para caracterizar y cuantificar la actividad bioestimulante de diversos productos seleccionados como posibles mejoradores del crecimiento y/o aliviadores del estrés. Las tecnologías de fenotipado de alto rendimiento, a las que se está prestando cada vez más atención para el cribado y desarrollo de productos, podrían proporcionar en el futuro medios muy eficientes en cuanto a tiempo y costes para cribado de nuevas sustancias, dosis óptimas, momento adecuado de aplicación y modo de acción de los compuestos con actividad bioestimulante.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por el programa de investigación e innovación Horizonte 2020 de la Unión Europea bajo el acuerdo de subvención Marie 826 Skłodowska-Curie nº 675006, el proyecto PHOBOS Prot. 2017FYBLPP y la Red Checa de Fenotipado de Plantas (CzPPN).

Referencias:

  1. Rouphael Y, Spíchal L, Panzarová K, Casa R y Colla G (2018). Fenotipado vegetal de alto rendimiento para el desarrollo de nuevos bioestimulantes: Del laboratorio al campo o del campo al laboratorio? Front. Plant Sci. 9:1197. doi: 10.3389/fpls.2018.01197
  2. De Diego N, Fürst T, Humplík JF, Ugena L, Podlešáková K y Spíchal L (2017). An Automated Method for High-Throughput Screening of Arabidopsis Rosette Growth in Multi-Well Plates and Its Validation in Stress Conditions. Front. Plant Sci. 8:1702. doi: 10.3389/fpls.2017.01702
  3. Ugena L, Hýlová A, Podlešáková K, Humplík JF, Doležal K, De Diego N y Spíchal L (2018). Characterization of Biostimulant Mode of Action Using Novel Multi-Trait High-Throughput Screening of Arabidopsis Germination and Rosette Growth. Front. Plant Sci. 9:1327. doi: 10.3389/fpls.2018.01327
  4. Paul K, Sorrentino M, Lucini L, Rouphael Y, Cardarelli M, Bonini P, Reynaud H, Canaguier R, Trtílek M, Panzarová K y Colla G (2019). Comprensión de la acción bioestimulante de los hidrolizados de proteínas de origen vegetal mediante fenotipado vegetal de alto rendimiento y metabolómica: A Case Study on Tomato. Front. Plant Sci. 10:47. doi: 10.3389/fpls.2019.00047

 

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